Die Deletion endothelialer Leptinrezeptoren bei Mäusen fördert die Ernährung

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 8276 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Fettleibigkeit begünstigt eine endotheliale Dysfunktion. Endothelzellen reagieren nicht nur, sondern fördern möglicherweise auch aktiv die Entwicklung von Fettleibigkeit und Stoffwechselstörungen. Unser Ziel war es, die Rolle endothelialer Leptinrezeptoren (LepR) für den Endothel- und Ganzkörperstoffwechsel sowie ernährungsbedingte Fettleibigkeit zu charakterisieren. Mäuse mit Tamoxifen-induzierbarer, Tie2.Cre-ERT2-vermittelter Deletion von LepR in Endothelzellen (End.LepR Knockout, KO) erhielten 16 Wochen lang eine fettreiche Diät (HFD). Körpergewichtszunahme, Serum-Leptinspiegel, viszerale Adipositas und Fettgewebeentzündung waren bei adipösen End.LepR-KO-Mäusen stärker ausgeprägt, wohingegen sich die Nüchtern-Serumglukose- und Insulinspiegel oder das Ausmaß der Lebersteatose nicht unterschieden. Bei End.LepR-KO-Mäusen wurden eine verringerte endotheliale Transzytose von exogenem Leptin im Gehirn, eine erhöhte Nahrungsaufnahme und eine erhöhte Gesamtenergiebilanz beobachtet, begleitet von einer Ansammlung von perivaskulären Makrophagen im Gehirn, wohingegen sich körperliche Aktivität, Energieverbrauch und Atmungsaustauschraten nicht unterschieden. Die Stoffwechselflussanalyse ergab keine Veränderungen im bioenergetischen Profil von Endothelzellen aus Gehirn oder viszeralem Fettgewebe, aber höhere Glykolyse- und Mitochondrienatmungsraten bei den aus der Lunge isolierten Zellen. Unsere Ergebnisse belegen eine Rolle endothelialer LepRs beim Transport von Leptin in das Gehirn und bei der neuronalen Kontrolle der Nahrungsaufnahme und deuten auch auf organspezifische Veränderungen in Endothelzellen, nicht aber auf den Stoffwechsel des gesamten Körpers hin.

Fettleibigkeit ist ein etablierter kardiovaskulärer Risikofaktor und wird häufig mit einer endothelialen Dysfunktion1 in Verbindung gebracht, einem der frühesten Anzeichen einer Gefäßerkrankung. Die schädlichen Auswirkungen von Fettleibigkeit werden durch eine Reihe von Faktoren verursacht, darunter chronische Entzündungen und Stoffwechselveränderungen, die mit einem erhöhten Körpergewicht einhergehen. Zusätzlich zu den von Entzündungszellen freigesetzten Zytokinen werden auch von Adipozyten produzierte Zytokine (sogenannte Adipokine) mit dem erhöhten Risiko für Herz-Kreislauf-Erkrankungen im Zusammenhang mit Fettleibigkeit in Verbindung gebracht. Fettleibigkeit ist unter anderem mit erhöhten zirkulierenden Leptinspiegeln verbunden2,3, einem Adipokin-Prototyp, der an der Regulierung des Körpergewichts und des Energieverbrauchs beteiligt ist4. Auf neuronalen Zellen exprimierte Leptinrezeptoren (LepRs) sind entscheidend für die Regulierung der Nahrungsaufnahme und des Energieverbrauchs4. LepRs sind auch auf vaskulären Endothelzellen vorhanden, die die Blut-Hirn-Schranke bilden5. Frühere Studien an Mäusen, die membrangebundene verkürzte LepRs auf Endothelzellen exprimierten, zeigten eine veränderte Aufnahme von Leptin im Gehirngewebe und eine teilweise Resistenz gegen ernährungsbedingte Fettleibigkeit6,7,8.

Leptin hat Funktionen, die über seine Aktivitäten als Sättigungsfaktor hinausgehen. In diesem Zusammenhang exprimieren auch Endothelzellen, die periphere Blutgefäße auskleiden, LepRs9. Experimentelle und klinische Studien haben gezeigt, dass Leptin an der Pathophysiologie der endothelialen Dysfunktion3 und anderen kardiovaskulären Pathologien beteiligt ist10,11. Wir haben zuvor berichtet, dass Mäuse, denen LepRs auf Endothelzellen fehlen, einen vaskulären Phänotyp aufweisen, der dem von leptinresistenten, fettleibigen Mäusen ähnelt12. Bei diesen Mäusen beobachteten wir eine ausgeprägtere viszerale Adipositas als Reaktion auf die Fütterung mit fettreicher Nahrung. Diese und andere neuere experimentelle Erkenntnisse legen nahe, dass Endothelzellen nicht nur auf Fettleibigkeit reagieren, sondern möglicherweise auch eine aktive Rolle bei der Energiehomöostase des gesamten Körpers und der Entwicklung von Fettleibigkeit spielen13,14,15. Dieses Konzept wurde jedoch nur in wenigen Studien untersucht, und die Mechanismen und Mediatoren sind erst am Anfang ihrer Entstehung16. In dieser Studie untersuchten wir die Hypothese, dass die genetische Deletion von LepR in Endothelzellen den metabolischen Phänotyp von Mäusen verändert und aktiv zur Entwicklung von durch fettreiche Ernährung (High-Fat-Diät, HFD) verursachter Fettleibigkeit beiträgt.

Mäuse mit induzierbarer Deletion von LepRs in Endothelzellen (End.LepR Knockout, KO) wurden zuvor generiert und hinsichtlich ihrer vaskulären12 oder kardialen17 Reaktion auf eine Verletzung untersucht. Die PCR-Analyse genomischer DNA zeigte eine induzierbare Tie2.ERT2-Cre-vermittelte Deletion des floxed LepR-Gens (sichtbar als LepR delta oder Δ) in Organen, die an der Kontrolle des Körpergewichts beteiligt sind, wie Gehirn oder viszerale (VAT) und subkutane (SCAT). ) Fettgewebe sowie in anderen Organen wie Dünndarm und Lunge (Abb. 1A). Eine quantitative Echtzeit-PCR-Analyse bestätigte signifikant reduzierte mRNA-Transkriptmengen sowohl der langen (Signalisierung) als auch der kurzen LepR-Isoformen in primären Endothelzellen, die aus dem Gehirn isoliert wurden (Abb. 1B, C), VAT (Abb. 1D, E) und Lunge (Abb. 1F, G) von End.LepR-KO-Mäusen und niedrige LepR-Immunsignale in CD31-positiven Endothelzellen wurden mittels Immunfluoreszenzmikroskopie bestätigt (Abb. 1H).

Generation von Mäusen mit induzierbarer genetischer Deletion von LepR in Endothelzellen. (A) Tamoxifen-induzierte, Cre-Rekombinase-vermittelte Genexzision von Leptinrezeptoren (∆LepR) in Biopsien von Gehirn, viszeralem Fettgewebe (VAT), subkutanem Fettgewebe (SCAT), Dünndarm und Lungengewebe. Die Bilder in voller Länge der Gele, aus denen die interessierenden Bereiche mit Banden ausgeschnitten wurden, sind in der Zusatzinformationsdatei aufgeführt. Quantitative Echtzeit-PCR-Analyse von LepR, langer (B,D,F) und kurzer (C,E,G) Isoform, mRNA-Spiegel in aus dem Gehirn isolierten Endothelzellen (B,C; n = 5–7 Mäuse pro Gruppe) , Mehrwertsteuer (D,E; n = 6 Mäuse pro Gruppe) oder Lunge (F,G; n = 6–8 Mäuse pro Gruppe) von End.LepR-WT- und End.LepR-KO-Mäusen. Die Daten wurden je nach Vorliegen einer Normalverteilung mithilfe des Student-t-Tests (C–G) oder des Mann-Whitney-Tests (B) analysiert. *p < 0,05, **p < 0,01 und ****p < 0,001. (H) Repräsentative Fluoreszenzmikroskopbilder der LepR-Expression (magenta) auf CD31-immunpositiven Endothelzellen (grün) in Gehirn, Mehrwertsteuer und Lunge von End.LepR-WT- und End.LepR-KO-Mäusen. Zellkerne wurden mithilfe von DAPI (blau) sichtbar gemacht. Größenbalken repräsentieren 20 µm.

Der experimentelle Arbeitsablauf zur Untersuchung der Rolle endothelialer Leptinrezeptoren für ernährungsbedingte Fettleibigkeit bei männlichen und weiblichen End.LepR-WT- und End.LepR-KO-Mäusen ist in Abb. 2A dargestellt. Bei Mäusen, die mit SD gefüttert wurden, unterschied sich das mittlere Körpergewicht zwischen End.LepR-WT- und End.LepR-KO-Mäusen nicht signifikant (Männer: 28,4 ± 0,4 vs. 28,1 ± 0,3 g, P = 0,5623; Weibchen: 21,1 ± 0,3 vs. 21,6). ± 0,2 g, P = 0,1210). Obwohl alle Mäuse als Reaktion auf HFD Fettleibigkeit entwickelten, waren die mittleren Körpergewichtsveränderungen und der Prozentsatz der Gewichtszunahme über 16 Wochen bei End.LepR-KO-Mäusen signifikant höher als bei altersentsprechenden End.LepR-WT-Kontrollen, und zwar bei beiden männlichen Mäusen (Abb . 2B,D) und weibliche (Abb. 2C,E) Mäuse. Die beobachteten Unterschiede waren moderat; Repräsentative Bilder von End.LepR-WT- und End.LepR-KO-Wurfgeschwistermäusen, die 16 Wochen lang entweder SD oder HFD gefüttert wurden, sind in Abb. 2F dargestellt.

Das Körpergewicht verändert sich als Reaktion auf eine fettreiche Ernährung. (A) Experimenteller Arbeitsablauf. Körpergewichtsverlaufskurven männlicher (B) und weiblicher (C) End.LepR-WT- und End.LepR-KO-Mäuse zu Beginn und nach Fütterung einer fettreichen Diät (HFD) für 4, 8, 12 und 16 Wochen. Die Anzahl der untersuchten Mäuse pro Gruppe ist in den Grafiken dargestellt. *p < 0,05 und **p < 0,01, bestimmt mit Two-Way ANOVA, dem Mehrfachvergleichstest von Sidak. Körpergewichtszunahme nach 16 Wochen HFD, ausgedrückt als Prozentsatz des anfänglichen Körpergewichts (auf 100 % eingestellt), bei männlichen (D) und weiblichen (E) End.LepR-WT- und End.LepR-KO-Mäusen. **p < 0,01, bestimmt mit dem Student-t-Test. (F) Repräsentative Fotos von männlichen und weiblichen End.LepR-WT- und End.LepR-KO-Mäusen, die 16 Wochen lang mit Standard-Labordiät oder fettreicher Diät gefüttert wurden.

Nach 16-wöchiger Fütterung mit HFD wurden die Mäuse getötet. Zu diesem Zeitpunkt unterschieden sich die Gewichte des viszeralen Fettgewebes (VAT) nur bei weiblichen End.LepR-KO-Mäusen signifikant, wohingegen sie bei Männern im Vergleich zu Frauen höher waren und sich zwischen End.LepR-WT und End.LepR-KO nicht signifikant unterschieden. KO-Mäuse (Abb. 3A). In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen waren die gesamten zirkulierenden Leptinspiegel, ein Indikator für die Masse des peripheren Fettgewebes18, nur bei weiblichen End.LepR-KO-Mäusen im Vergleich zu End.LepR-WT-Kontrollen signifikant erhöht und unterschieden sich nicht bei Männern (Abb. 3B). ). Die Plasmaspiegel des löslichen Leptinrezeptors (sLepR), dem Hauptbindungsprotein und Inhibitor von Leptin19,20, unterschieden sich nicht zwischen männlichen und weiblichen End.LepR-WT- und End.LepR-KO-Mäusen (nicht gezeigt). Die histologische Analyse von H&E-gefärbten Querschnitten durch VAT bestätigte eine erhöhte mittlere Fläche einzelner Adipozyten bei weiblichen End.LepR-KO-Mäusen und eine höhere, aber ähnliche mittlere Adipozytenfläche bei männlichen Mäusen (Abb. 3C, D). Eine ausgeprägtere Adipozytenhypertrophie in Abwesenheit von endothelialem LepR wurde auf molekularer Ebene bestätigt: Die QPCR-Analyse der gesamten VAT-Homogenate von weiblichen Mäusen zeigte, dass die Adipozyten-mRNA-Spiegel des Fettsäure-bindenden Proteins-4 (Fabp4) (Abb. 3E), Peroxisom-Proliferator, vorhanden sind -aktivierter Rezeptor Gamma (Pparg) (Abb. 3F) und Catenin Beta-1 (Ctnnb1) (Abb. 3G), die am Lipidtransport oder der Lipogenese21 beteiligt sind, waren ebenfalls signifikant erhöht, wohingegen die mRNA-Spiegel von Perilipin (Plin), das die Lipolyse steuert, signifikant erhöht waren waren bei End.LepR-KO-Mäusen signifikant reduziert (Abb. 3H). Andererseits unterschieden sich die mRNA-Spiegel von Leptin nicht signifikant (Abb. 3I). Bemerkenswert ist, dass Fabp4 auch auf mikrovaskulären Endothelzellen exprimiert wird, die am Fettsäuretransport im Fettgewebe beteiligt sind22. In dieser Hinsicht unterschieden sich die Fabp4-mRNA-Spiegel nicht signifikant zwischen Endothelzellen, die aus der Mehrwertsteuer von End.LepR-WT- und -KO-Mäusen isoliert wurden (P = 0,616; n = 5 biologische Replikate pro Gruppe; nicht gezeigt). Im Einklang mit der verbesserten Adipozytendifferenzierung waren die mRNA-Spiegel des Preadipozytenfaktors 1 (Pref1, auch bekannt als Dlk1) in End.LepR-KO-Mäusen signifikant reduziert (Abb. 3J), wohingegen die mRNA-Spiegel des aus Blutplättchen stammenden Wachstumsfaktors Alpha (Pdgfra ; Abb. 3K), ein Marker für Fibroblasten und Adipozyten-Vorläuferzellen23, oder Marker für die Zellproliferation, wie Cyclin D1 (Ccnd1; Abb. 3L) oder Proliferierendes Zellkernantigen (Pcna; nicht gezeigt), unterschieden sich nicht signifikant.

Viszerale Adipositas, Hyperleptinämie und adipogene Genexpression. Gewichte des viszeralen Fettgewebes (VAT) (A) und Serum-Leptinspiegel (B) bei männlichen und weiblichen End.LepR-WT- und End.LepR-KO-Mäusen, denen 16 Wochen lang eine fettreiche Diät (HFD) verabreicht wurde. Die Daten wurden mithilfe des Kruskal-Wallis-Tests, dem Mehrfachvergleichstest von Dunn, verglichen. *p < 0,05, ***p < 0,001 und ****p < 0,0001. ns, nicht signifikant. Die Zwei-Wege-ANOVA-Analyse zeigte eine signifikante Interaktion zwischen Geschlecht und Deletion (p = 0,0152 in A, p = 0,0024 in B). (C) Repräsentative mikroskopische Bilder von H&E-gefärbten, in Paraffin eingebetteten Mehrwertsteuer-Gewebeschnitten von End.LepR-WT- und End.LepR-KO-Mäusen. Maßstabsbalken repräsentieren 200 µm. Die Ergebnisse der morphometrischen Analyse der mittleren Adipozytenfläche sind in (D) dargestellt. Die Daten wurden mithilfe der One-Way-ANOVA, dem Mehrfachvergleichstest von Sidak, verglichen. **p < 0,01 und ****p < 0,0001. Die Zwei-Wege-ANOVA-Analyse zeigte eine signifikante Interaktion zwischen Geschlecht und Deletion (p = 0,0117). Relative mRNA-Expression von Fettsäure-bindendem Protein-4 (Fabp4; E), Peroxisom-Proliferator-aktiviertem Rezeptor Gamma (Pparg; F), Catenin Beta-1 (Ctnnb1; G), Perilipin-1 (Plin; H), Leptin ( Lep; I), Preadipozytenfaktor 1 (Pref-1; J), aus Blutplättchen gewonnener Wachstumsfaktor Alpha (Pdgfra; K) und Cyclin D1 (Ccnd1; L) in der Mehrwertsteuer weiblicher End.LepR-KO-Mäuse (n = 12) nach 16 Wochen HFD. Die Daten werden als Genexpression relativ zu weiblichen End.LepR-WT-Wurfgeschwistermäusen (n = 9) unter Verwendung der ΔΔCt-Methode nach Normalisierung auf die Expression des Referenzgens (RPLO) angegeben. Die Daten wurden mit dem Student-t-Test (F,H) oder dem Mann-Whitney-Test (E,G) analysiert. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 und ****p < 0,0001.

Hinsichtlich der Unterschiede im Ausmaß der mit Fettleibigkeit einhergehenden VAT-Entzündung ergab die Durchflusszytometrie eine signifikant höhere Anzahl von CD45+ Lin− CD11b+ Ly6Chigh CXCR1+ MHCII− entzündlichen Monozyten (Abb. 4A, B) und CD45+ Lin− CD11b− CD11c+ MHCII+ Monozyten (Abb. 4C, D) in der Mehrwertsteuer von End.LepR-KO-Mäusen im Vergleich zu End.LepR-WT-Kontrollen. Die Immunhistochemie bestätigte eine höhere Anzahl Mac2-positiver Makrophagen (Abb. 4E, F), die als kronenartige Strukturen (CLS; Abb. 4G) organisiert oder mit mehrkernigen Riesenzellen (MGS; Abb. 4H) fusioniert waren24. Die Gesamtzahl der CD31-immunpositiven Endothelzellen in der Mehrwertsteuer unterschied sich nicht zwischen End.LepR-WT- und End.LepR-KO-Mäusen (Suppl. Abb. 1A, B). Aufgrund der größeren mittleren Adipozytenfläche führt dies zu einer deutlich verringerten Anzahl von Adipozyten pro Mikroskopfeld (P = 0,0077 vs. End.LepR-WT bei Frauen; P = 0,8359 vs. End.LepR-WT bei Männern; Daten nicht gezeigt). ) war die relative Anzahl CD31-immunpositiver Zellen pro Adipozyten bei weiblichen End.LepR-KO-Mäusen signifikant erhöht (Suppl. Abb. 1C). Die Messenger-RNA-Spiegel von Markern der Endothelzellaktivierung unterschieden sich nicht signifikant zwischen Endothelzellen von End.LepR-WT- und End.LepR-KO-Mäusen (Suppl. Abb. 2A – C).

Entzündung des viszeralen Fettgewebes. Untergruppen von Immunzellen wurden in Homogenaten des viszeralen Fettgewebes (VAT) von End.LepR-WT- und End.LepR-KO-Mäusen, die 16 Wochen lang mit fettreicher Diät (HFD) gefüttert wurden, mittels Durchflusszytometrie analysiert. Repräsentative Punktdiagramme nach der Analyse von MHC-II und Ly6C sind in (A), von CD11c und MHC11 in (C), die Ergebnisse der quantitativen Analyse von CD45+ Lin− CD11b+ Ly6Chigh CXCR1+ MHCII− Zellen in (B) und von CD45+ dargestellt Lin− CD11b− CD11c+ MHCII− in (D). Die Daten werden als % der gesamten lebenden Zellen in der Mehrwertsteuer ausgedrückt und mit der One-Way-ANOVA, dem Mehrfachvergleichstest von Sidak, verglichen. *p < 0,05, **p < 0,01 und ***p < 0,005. (E) Repräsentative Bilder nach immunhistochemischer Analyse von Makrophagen in der Mehrwertsteuer von End.LepR-WT- und End.LepR-KO-Mäusen, die 16 Wochen lang mit HFD gefüttert wurden. Maßstabsbalken repräsentieren 100 μm. Die Ergebnisse der quantitativen Analyse des Mac2-immunpositiven Bereichs sind in (F) dargestellt, die Anzahl der kronenähnlichen Strukturen (CLS) bzw. kernhaltigen Riesenzellen pro 100 Adipozyten sind in (G) bzw. (H) dargestellt. Die Daten wurden mit dem Student-t-Test analysiert. *p < 0,05 und **p < 0,01.

Fettleibigkeit und chronische (Fettgewebe-)Entzündungen werden häufig durch Stoffwechselveränderungen wie Insulinresistenz und Diabetes mellitus erschwert. In dieser Hinsicht ergab die Analyse der Serumglukose- und Insulinspiegel bei End.LepR-WT- und End.LepR-KO-Mäusen, die sechs Stunden lang gefastet hatten, keine Unterschiede in der Serumglukose (Suppl. Abb. 3A) oder im Seruminsulin (Suppl. Abb. 3B) Ebenen. Glukosetoleranztests bestätigten keine signifikanten Unterschiede bei Mäusen, die 16 Wochen lang mit SD (Suppl. Abb. 3C) oder HFD gefüttert wurden (Suppl. Abb. 3D), obwohl bei letzteren ein Trend zu einer schnelleren Glukoseentfernung beobachtet wurde. Auch das mittlere Lebergewicht unterschied sich nicht zwischen End.LepR-WT- und -KO-Mäusen (Suppl. Abb. 4A), und die histologische Analyse kryoeingebetteter Querschnitte nach der Färbung mit Oil Red O ergab ähnliche Mengen an gespeicherten neutralen Lipiden (Suppl. Abb. 4B,C).

Um zu untersuchen, ob Unterschiede in der täglichen Nahrungsaufnahme, dem Energieverbrauch oder der körperlichen Aktivität zu der ausgeprägteren Fettleibigkeit bei End.LepR-KO-Mäusen beigetragen haben, wurde indirekte Kalorimetrie eingesetzt. Einzelne männliche und weibliche Wurfgeschwistermäuse wurden eine Woche lang auf SD beobachtet, gefolgt von einer einwöchigen Beobachtung auf HFD (n = 3 unabhängige Experimente; n = 12 biologische Wiederholungen). End.LepR-KO-Mäuse zeigten einen höheren Gesamtnahrungsverbrauch (Abb. 5A – D) und eine höhere Gesamtenergiebilanz (Abb. 5E, F). Andererseits unterschied sich die tägliche körperliche Aktivität, gemessen als Fußgängerbewegung (nicht gezeigt), Bewegungsaktivität (Suppl. Abb. 5A, B) oder Gesamtdistanz bei der Käfigbewegung (Suppl. Abb. 5C, D), nicht signifikant. Auch der Sauerstoffverbrauch (VO2; Suppl. Abb. 6A, B), die Kohlendioxidproduktion (VCO2; Suppl. Abb. 6C, D) und die Atmungsaustauschraten (Suppl. Abb. 6E, F) waren ähnlich, was auf eine unveränderte Energieoxidation hinweist Substrate in End.LepR-KO-Mäusen.

Gesamtnahrungsaufnahme, Energiebilanz und Transport von exogenem Leptin ins Gehirn. Diagramm der gesamten Nahrungsaufnahmezeit männlicher (A) und weiblicher (C) End.LepR-WT- und End.LepR-KO-Mäuse (n = 3 pro Gruppe), aufgezeichnet in Stoffwechselkäfigen in 12-stündigen Tag-Nacht-Zyklen. Mäuse erhielten 7 Tage lang Standard-Labordiät (SD), gefolgt von einer Umstellung auf fettreiche Diät (HFD) für weitere 7 Tage. Zusammenfassung der gesamten Nahrungsaufnahme über einen Zeitraum von 14 Tagen für männliche (B) und weibliche (D) End.LepR-WT- und End.LepR-KO-Mäuse. Zeitdiagramm der Gesamtenergiebilanz vor und nach der Ernährungsumstellung von SD auf HFD bei männlichen (E) und weiblichen (F) End.LepR-WT- und End.LepR-KO-Mäusen. (G) Repräsentative Fluoreszenzmikroskopbilder von kryo-eingebetteten Gehirnabschnitten von End.LepR-WT- und End.LepR-KO-Mäusen, ip mit Rhodamin-markiertem Leptin (rot) injiziert und ic mit FITC-markiertem Lektin injiziert, um Endothelzellen sichtbar zu machen ( grün) immungefärbt für LepR (Magenta). DAPI-positive Zellkerne sind blau. (H) Zusammenfassung der quantitativen Analyse des Rhodamin-Leptin-positiven Bereichs pro Gesamtfläche von 40 × mikroskopischen Feldern. **p = 0,01, bestimmt mit dem Student-t-Test.

Die Erfassung der zirkulierenden Spiegel des Sättigungshormons Leptin erfordert dessen Bindung an Leptinrezeptoren, die auf Zellen der Blut-Hirn-Schranke exprimiert werden, gefolgt von einer Transzytose25,26,27. Eine fluoreszenzmikroskopische Analyse zeigte die Bindung von exogenem, mit Rhodamin markiertem rekombinantem Leptin an Endothelzellen, die die mittlere Eminentia und das gesamte Gehirn bei End.LepR-WT-Mäusen auskleiden, wohingegen im Gehirn von End.LepR-WT-Mäusen geringe Signale von exogen verabreichtem Leptin festgestellt wurden. KO-Mäuse. Repräsentative Beispiele sind in Abb. 5G dargestellt, die Ergebnisse der quantitativen Analyse in Abb. 5H. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die ausgeprägtere Fettleibigkeit und höhere Nahrungsaufnahme, die bei Mäusen ohne endothelialen LepR beobachtet wurden, auf eine beeinträchtigte Transzytose des Sättigungsfaktors über die Blut-Hirn-Schranke zurückzuführen ist. Die Analyse von VAT-Gewebeschnitten ergab ähnliche Ergebnisse, nämlich dass Rhodamin-markiertes Leptin in End.LepR-KO-Mäusen signifikant reduziert war (Suppl. Abb. 7A, B).

Um die Rolle von LepR auf Endothelzellen für die Kontrolle des Körpergewichts über die Regulierung der Leptin-Transzytose hinaus weiter zu untersuchen, wurden primäre Endothelzellen aus Gehirn und Mehrwertsteuer von End.LepR-KO- und End.LepR-WT-Mäusen sowie deren bioenergetische Profile isoliert in Echtzeit untersucht. Die extrazelluläre Ansäuerungsrate (ECAR; ein Indikator für Glykolyse) und die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR; ein Indikator für mitochondriale Atmung) unterschieden sich jedoch nicht signifikant zwischen Endothelzellen, die aus dem Gehirn von End.LepR-WT- und -KO-Mäusen isoliert wurden. weder bei Mäusen, denen SD verabreicht wurde, noch bei Mäusen, denen HFD verabreicht wurde (Abb. 6A, B; Rohdaten sind in Suppl. Abb. 8A, B dargestellt). ECAR und OCR waren auch in Endothelzellen, die aus der Mehrwertsteuer von End.LepR-KO-Mäusen isoliert wurden, im Vergleich zu End.LepR-WT-Kontrollen ähnlich (Abb. 6C, D; Rohdaten sind in Suppl. Abb. 8C, D dargestellt).

Gehirnentzündung und energetische Profile von primären Gehirn- und VAT-Endothelzellen. Zusammenfassung der Ergebnisse nach Analyse der Glykolyse und Mitochondrienatmung in lebenden primären Endothelzellen, isoliert aus Gehirn (A, B) oder viszeralem Fettgewebe (VAT; C, D) von weiblichen End.LepR-WT (n = 4–5) und End .LepR-KO (n = 7) Mäuse wurden 16 Wochen lang mit Standard-Labordiät (SD) oder fettreicher Diät (HFD) gefüttert. Die Analysen wurden mit dem Extrazellulärflussanalysator Seahorse XF96e durchgeführt. Die Ergebnisse wurden auf die Anzahl der Zellen normalisiert und als -fache Veränderung im Vergleich zu End.LepR-WT-Mäusen ausgedrückt. Die Daten wurden mithilfe der One-Way-ANOVA, dem Mehrfachvergleichstest von Sidak, analysiert. Ns, nicht signifikant. Repräsentative Immunfluoreszenzbilder kryoeingebetteter Hirnschnitte von End.LepR-WT- (n = 7–8) und End.LepR-KO-Mäusen (n = 7), die 16 Wochen lang mit fettreicher Ernährung gefüttert wurden, nach Färbung mit Antikörpern gegen CD206 (grün) und CD31 (rot) (E) oder gegen Mac2 (grün) und VEGF (rot) (H). Größenbalken repräsentieren 20 µm. Ergebnisse nach Quantifizierung der Fläche, die immunpositiv für CD206 (F), CD31 (G), Mac2 (I) oder VEGF (J) ist, ausgedrückt pro Gesamtfläche von 40 × mikroskopischen Feldern. Die Daten wurden mit dem Student-t-Test analysiert. *p < 0,05 und **p < 0,01.

Frühere Studien deuteten darauf hin, dass von Entzündungszellen abgeleitete Zytokine eine Rolle bei der Aufrechterhaltung des Endothelzellstoffwechsels bei Fettleibigkeit spielen28. Immunfluoreszenzmikroskopische Analysen von Gehirnschnitten zeigten, dass die HFD-Fütterung mit einer hohen Anzahl von Entzündungszellen verbunden war, ähnlich wie bei der Mehrwertsteuer. Insbesondere war die Anzahl der CD206-immunpositiven Zellen in der Nähe von CD31-immunpositiven Endothelzellen (Abb. 6E – G) sowie die Anzahl der Mac2-immunpositiven Makrophagen, die VEGF exprimierten (Abb. 6H – J), in End.LepR höher -KO-Mäuse im Vergleich zu End.LepR-WT-Mäusen.

Im Gegensatz zu den Befunden im Gehirn und in der Mehrwertsteuer waren die glykolytischen und mitochondrialen ATP-Produktionsraten in aus der Lunge von End.LepR-KO-Mäusen isolierten Endothelzellen unabhängig von der Ernährung signifikant erhöht (Abb. 7A – D). Jedoch qPCR-Analyse der mRNA-Spiegel von Glukosetransportern (z. B. Glut1; Abb. 7E) oder glykolytischen Enzymen (z. B. Hk2, Pfkb3; nicht gezeigt) sowie mitochondrialer Marker (z. B. Idh; Abb. 7F), Regulatoren der Mitochondrienfunktion (dh Sirt3; Abb. 7G) oder Aktivatoren der mitochondrialen Biogenese (dh Pcg1α; nicht gezeigt) unterschieden sich nicht signifikant zwischen primären ECs, die aus den Lungen von End.LepR-WT- und -KO-Mäusen isoliert wurden, was auf alternative Wege der Stoffwechselaktivierung schließen lässt.

Energiestoffwechsel und Expression von glykolytischen Enzymen oder mitochondrialen Markern in primären Lungenendothelzellen. Repräsentative Beispiele für die extrazelluläre Ansäuerungsrate (ECAR; A) und die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR; B) in lebenden primären Endothelzellen, die aus weiblichen End.LepR-WT (n = 7) und End.LepR-KO (n = 7) isoliert wurden ) Mäusen, die mit Standardnahrung gefüttert wurden. Die Daten wurden mithilfe der Zwei-Wege-ANOVA, den Mehrfachvergleichstests von Sidak, analysiert. *p < 0,05 und **p < 0,01 vs. End.LepR-WT-Mäuse zum gleichen Zeitpunkt. Nichtsignifikante Unterschiede werden nicht dargestellt. Die Zusammenfassung der Ergebnisse aus n = 4 unabhängigen Experimenten zur Messung des ECAR (C) oder OCR (D) zur Bestimmung der Glykolyse oder der Mitochondrienatmung bei End.LepR-WT- und End.LepR-KO-Mäusen, denen Standarddiät (SD) oder fettreiche Ernährung verabreicht wurde Diät (HFD). Die Ergebnisse wurden auf die Anzahl der Zellen normalisiert und als -fache Veränderung im Vergleich zu End.LepR-WT-Mäusen ausgedrückt. Die Daten wurden mithilfe der One-Way-ANOVA, den Mehrfachvergleichstests von Sidak, verglichen. *p < 0,05, **p < 0,01 und ****p < 0,0001 im Vergleich zu End.LepR-WT-Mäusen. Quantitative Echtzeit-PCR-Analyse von Glut1 (E), Idh (F) und Sirt3 (G) in primären Lungenendothelzellen von weiblichen End.LepR-WT- und End.LepR-KO-Mäusen (n = 10 pro Gruppe). Die Daten wurden mithilfe des Student-t-Tests verglichen. Ns nicht signifikant.

Das Adipokin Leptin steuert das Körpergewicht und den Energieverbrauch, hauptsächlich durch Einwirkung auf LepRs auf neuronalen Zellen29. Leptinrezeptoren werden auf vielen verschiedenen Zelltypen im gesamten Körper exprimiert30. Hier zeigen wir, dass Leptinrezeptoren auf Endothelzellen an der Regulierung der Nahrungsaufnahme und des Körpergewichts beteiligt sind, und identifizieren einen verringerten Transport von Leptin durch die Blut-Hirn-Schranke als einen möglichen Mechanismus. Erhöhte zirkulierende Leptinspiegel trotz erhöhtem Körpergewicht bestätigten das Vorhandensein einer Leptinresistenz bei Mäusen, denen endotheliale Leptinrezeptoren fehlen. Andere indirekte Folgen des erhöhten Körpergewichts waren ebenfalls ausgeprägter, wie z. B. eine Entzündung der Mehrwertsteuer und die adipogene Genexpression, während sich Serumglukose oder Insulin, der Stoffwechsel des gesamten Körpers oder die körperliche Aktivität nicht veränderten. Die beobachteten Veränderungen waren moderat und nur bei Mäusen mit fettleibiger Ernährung messbar, was darauf hindeutet, dass endotheliale LepRs nicht ursächlich an der Entstehung von Fettleibigkeit beteiligt sind, sondern vielmehr eine modifizierende Rolle spielen.

Die Regulierung des Körpergewichts und der Energiehomöostase ist ein komplexer Prozess, der im Zentralnervensystem und auf der Ebene peripherer Organe, einschließlich Fettgewebe, Skelettmuskel und Leber, gesteuert wird31. Eine Rolle von Leptin und seinen Rezeptoren bei der Kontrolle der Nahrungsaufnahme und des Energieverbrauchs wurde vor einigen Jahren durch Befunde über schwere Fettleibigkeit bei ob/ob-Mäusen mit Leptinmangel oder bei db/db-Mäusen, die mutierte, nicht funktionierende LepRs auf allen Zellen exprimierten, nahegelegt Durch den Körper. Dies unterstreicht die primäre Rolle von Leptinrezeptoren auf neuronalen Zellen bei der Körpergewichtshomöostase, der selektiven genetischen Deletion von LepR in allen Neuronen (unter Verwendung von Synapsin I-Cre)32 oder definierten neuronalen Zellpopulationen, wie z. B. solchen, die Agouti-verwandtes Peptid exprimieren33, jedoch nicht in Hepatozyten32 verursachte schwere Fettleibigkeit und Diabetes, und der Phänotyp von db/db-Mäusen konnte durch neuronale Reexpression von Leptinrezeptoren gerettet werden34,35. Obwohl gezeigt wurde, dass das Vorhandensein von LepR auf neuronalen Zellen „sowohl erforderlich als auch ausreichend“ ist36, wurde auch über eine Rolle von Leptinrezeptoren auf nicht-neuronalen Zellen bei der Kontrolle des Körpergewichts berichtet37. Frühere genetische und pharmakologische Ablationsstudien an Mäusen ergaben, dass die Leptin-Signalübertragung in Astrozyten38,39 oder Oligodendrozyten-Vorläufern/Gliazellen40 eine Rolle bei der Aufrechterhaltung einer normalen Energiehomöostase spielt. Andere LepR-exprimierende Zellen im Gehirn, wie perivaskuläre41,42 oder Endothelzellen5,43, sind ebenfalls an der Kontrolle des Körpergewichts durch das Zentralnervensystem beteiligt, indem sie als Vermittler der Leptinaufnahme fungieren. Die genetische Deletion von LepR unter Verwendung von Slco1c1 (Solute Carrier Organic Anion Transporter Family Member 1C1), einem Transmembranrezeptor, der auf Gehirnkapillarendothelzellen44 exprimiert wird, als Cre-Treiber ergab, dass der Transport von radioaktiv markiertem Leptin in den Hypothalamus um etwa 40 % reduziert wurde36. Obwohl keine Reaktion auf exogenes Leptin beobachtet wurde, war die über drei Monate beobachtete Körpergewichtszunahme nur bei Mäusen, denen HFD36 verabreicht wurde, ähnlich wie unsere Ergebnisse betroffen. Bei mit HFD gefütterten Mäusen wurden auch leicht erhöhte Plasma-Leptinspiegel und Körpergewicht mit globaler Deletion kurzer LepR-Isoformen beobachtet45. Obwohl die endotheliale Expression beider LepR-Isoformen in unserer Studie reduziert war, deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass das Fehlen der kurzen LepR-Isoform, also der Isoform, die auf peripheren Zellen allgemein exprimiert wird, ausreichend gewesen sein könnte.

Leptinrezeptoren werden auf Endothelzellen im gesamten Körper exprimiert48. Um ihre Rolle zu untersuchen, wurden in früheren Studien Mäuse verwendet, die konstitutiv membrangebundene, verkürzte LepRs in Tie2-exprimierenden Zellen exprimierten6,8, das heißt Endothelzellen, aber auch hämatopoetische Zellen. Diese sogenannten ELKO-Mäuse waren teilweise vor Fettleibigkeit geschützt und zeigten trotz erhöhter Leptinspiegel im Blut einen moderat verbesserten Stoffwechselphänotyp als Reaktion auf HFD8. Im Gegensatz zu diesen früheren Berichten wurden in der vorliegenden Studie Mäuse untersucht, bei denen das erste Exon von loxP-Sequenzen flankiert war, um LepR nach der Cre-Rekombination32 vollständig zu löschen, und die Cre-Rekombinaseaktivität wurde bei erwachsenen Mäusen induziert, um selektiv auf Tie2-exprimierendes Endothel zu zielen keine hämatopoetischen Zellen49. Dementsprechend wurde die HFD auch später und nicht im Alter von 6 Wochen8 begonnen, um so die normalerweise während des Wachstums auftretende Gewichtszunahme zu vermeiden.

Fettleibigkeit beim Menschen entsteht als Folge eines Ungleichgewichts zwischen Energieaufnahme und -verbrauch, möglicherweise als Folge einer beeinträchtigten Leptinsignalisierung bei erhöhten zirkulierenden Leptinspiegeln. Die indirekte Kalorimetrie zeigte signifikante Unterschiede in der Nahrungsaufnahme und der Gesamtenergiebilanz bei mit HFD gefütterten End.LepR-KO-Mäusen, was mit den „wahrgenommenen“ niedrigen Leptinspiegeln nach der endothelialen LepR-Deletion und einem beeinträchtigten Transport von Leptin durch die Blut-Hirn-Schranke übereinstimmte die Mechanismen, die der Entwicklung einer Leptinresistenz bei Fettleibigkeit zugrunde liegen50. Bemerkenswert ist, dass der Leptintransport über die Blut-Hirn-Schranke bei Mäusen, die eine verkürzte Form von LepR in Tie2-exprimierenden Zellen oder Astrozyten exprimieren, nicht verändert war7. Einige Studien deuten darauf hin, dass der Leptintransport über die Blut-Hirn-Schranke bei adipösen Mäusen intakt ist51 oder dass Leptin das Gehirn über den direkten Transport durch zirkumventrikuläre Organe erreichen könnte52. Tanyzyten, ein spezialisierter Gliazelltyp, der den Boden des dritten Ventrikels auskleidet, sollen den Transport von peripher verabreichtem Leptin in das Gehirn vermitteln53, und die tanyzytenspezifische Deletion von LepRs verursachte Hyperleptinämie und eine erhöhte Körpergewichtszunahme54, obwohl andere Labore Leptin fanden -induzierte Veränderungen in der hypothalamischen STAT3-Signalisierung, die nicht von Tanyzyten abhängen55. Bemerkenswert ist, dass der Transport von Leptin durch die Blut-Hirn-Schranke nicht nur von LepRs abhängt, sondern auch von seiner Interaktion mit anderen Rezeptoren wie EGFR oder der Bindung von Leptin an andere Rezeptoren wie Megalin/LRP256,57. Obwohl gezeigt wurde, dass die Affinität von Leptin zur Bindung an diese Rezeptoren viel geringer ist als die von LepR58, können diese Mechanismen bei Hyperleptinämiezuständen relevant werden.

Im Einklang mit der Entwicklung einer (funktionellen) Leptinresistenz bei End.LepR-KO-Mäusen war Fettleibigkeit mit erhöhten Leptinspiegeln verbunden. Obwohl sich die Leptin-mRNA-Expressionsniveaus in der Mehrwertsteuer von End.LepR-WT- und End.LepR-KO-Mäusen nicht unterschieden, was die Ergebnisse bei ELKO-Mäusen bestätigt6, könnte eine erhöhte Anzahl von Leptin produzierenden Fettzellen zu dieser Beobachtung beigetragen haben. Erhöhte Leptinspiegel sind möglicherweise nicht nur eine Folge der erhöhten Fettgewebemasse, sondern auch eine Folge der verringerten endothelialen LepR-Aufnahme in das Gehirn oder andere Organe6. Was unsere Beobachtung einer erhöhten viszeralen Adipositas und Hyperleptinämie vor allem bei weiblichen Mäusen betrifft, führen wir sie auf die Tatsache zurück, dass HFD relativ spät im Leben begonnen wurde und dass Unterschiede in diesen Parametern bei den ohnehin schon schwereren männlichen Mäusen möglicherweise nicht erkennbar waren. Frühere In-situ-Hybridisierungsstudien ergaben keine Unterschiede in der LepR-Expression im Nucleus arcuatus, im ventromedialen Nucleus, im Thalamus und im piriformen Kortex zwischen männlichen und weiblichen Ratten, obwohl die LepR-Genexpression als Reaktion auf die Verabreichung von Östradiol abnahm und nach der Ovarektomie zunahm59.

Im Hinblick auf die Rolle von Leptinrezeptoren auf Endothelzellen, die außerhalb der Kontrolle des Leptintransports zu neuronalen Zentren der Körpergewichtskontrolle liegen, haben wir gezeigt, dass eine induzierbare genetische Deletion endothelialer Leptinrezeptoren bei Mäusen oder eine siRNA-vermittelte Herunterregulierung von Leptinrezeptoren in menschlichen Endothelzellen möglich ist führt zu einer Autophagie der Herzendothelzellen, ähnlich der mTOR-Hemmung oder dem Zellmangel17. In der vorliegenden Studie wurden Stoffwechselveränderungen in Endothelzellen nur bei solchen beobachtet, die aus peripheren Organen isoliert wurden, von denen nicht bekannt ist, dass sie an der Kontrolle des Körpergewichts beteiligt sind, wie z. B. der Lunge, wohingegen der Umgang mit Energiesubstraten bei denjenigen, die aus Gehirn und Mehrwertsteuer isoliert wurden, unverändert blieb. In Entzündungszellen produzierte Faktoren könnten die endothelialen Stoffwechselfunktionen aufrechterhalten und als Schutzmechanismus gewirkt haben, wie kürzlich für VEGF-produzierende perivaskuläre Makrophagen im Gehirn adipöser Mäuse gezeigt wurde28. Einzelzellsequenzierungsanalysen zeigten kürzlich organspezifische Unterschiede in der Anfälligkeit für Fettleibigkeit60, die ebenfalls eine Rolle gespielt haben könnten, obwohl dies in der vorliegenden Studie nicht untersucht werden konnte. Auch das Fehlen von LepR auf Endothelzellen könnte den Fettstoffwechsel durch Veränderung der sympathischen Fettinnervation61 oder angiokrinen Mediatoren62 beeinflusst haben.

Zusammenfassend belegen unsere Ergebnisse, dass endotheliale LepRs eine Rolle bei der Vermittlung des Transports von Leptin in das Gehirn und der neuronalen Kontrolle der Nahrungsaufnahme spielen, jedoch nicht beim gesamten Energiestoffwechsel des Körpers, wohingegen die Energieproduktion in Endothelzellen auf organspezifische Weise verändert wurde .

Die Erzeugung von Mäusen mit Tamoxifen-induzierbarer, Tie2.Cre-ERT2-vermittelter Deletion von LepR in Endothelzellen wurde bereits zuvor beschrieben12,17. Zur Aktivierung der Cre-Rekombinase wurden Mäuse (im Alter von 6 Wochen) 6 Wochen lang mit Tamoxifencitrat-haltigem Nagetierfutter (Envigo; TD.130860) gefüttert49. Genomische DNA aus Gehirn, Lunge, Dünndarm, subkutanem Fettgewebe (SCAT) und viszeralem Fettgewebe (VAT) wurde unter Verwendung eines Direct PCR-Lysereagenz (Peqlab) mit 0,2 mg/ml Proteinase K (Peqlab) isoliert. Der Maus-Genotyp wurde unter Verwendung der folgenden Primer bestimmt: Tie2.Cre (Tie2Cre1: 5′-CGA GTG ATG AGG TTC GCA AG-3′; Tie2Cre2: 5′-TGA GTG AAC GAA CCT GGT CG-3′); LepR (LepRflox1: 5′-GTC ACC TAG GTT AAT GTA TTC-3′; LepRflox2: 5′-TCT AGC CCT CCA GCA CTG GAC-3′. Die Tamoxifen-induzierte Deletion des LepR-Gens wurde mit den Primern bestätigt: LepRflox1: 5 ′-GTC ACC TAG GTT AAT GTA TTC-3′ und LepR delta/∆: 5′-GCA ATT CAT ATC AAA ACG CC-3′). Geschlechtsgleiche Wurfgeschwister Tie2.ERT2-WT LepRflox/flox-Mäuse, die mit Tamoxifen-haltigem Nagetierfutter gefüttert wurden, wurden während der gesamten Studie als Kontrollen verwendet.

Nach der Tamoxifen-Diät erhielten männliche und weibliche Wurfgeschwister 2 Wochen lang die Standard-Labordiät (SD) für Mäuse (V1124-300; ssniff®) und wurden dann nach Belieben auf 45 kcal-% HFD (D12451; Research Diets) umgestellt, um Fettleibigkeit zu induzieren . Das Körpergewicht wurde vor und alle 4 Wochen über insgesamt 16 Wochen bestimmt. Alle experimentellen Verfahren mit Tieren waren von vornherein von der örtlichen Tierethikkommission (Translationales Tierforschungszentrum, Universitätsmedizin Mainz) und dem Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz (Tiergenehmigung G16-1-081) genehmigt worden und entsprachen den nationalen Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Die Studie wird gemäß den ARRIVE-Richtlinien berichtet.

Um den Energieverbrauch, die körperliche Aktivität, den O2-Verbrauch und die CO2-Produktion sowie die Nahrungs- und Wasseraufnahme kontinuierlich und gleichzeitig zu messen, wurde eine Untergruppe von Mäusen auf SD in Stoffwechselkäfige (Promethion High-Definition Multiplexed Respirometry Cage; Sable Systems™) überführt. Jeder Käfig war mit Aspen-Chips ausgekleidet, ein Futtertrichter und eine Wasserflasche waren mit einem im Käfigdeckel eingebauten System zur Überwachung der Futter-/Wasseraufnahme verbunden. Die körperliche Aktivität wurde in Echtzeit mithilfe des BXYZ-Beam-Break-Aktivitätsmonitorsystems überwacht. Nach einer Äquilibrierungsperiode von 5 Tagen an Standard-Tierhaltungsbedingungen wurden die Stoffwechselparameter über 7 Tage auf SD aufgezeichnet, gefolgt von 45 % HFD für weitere 7 Tage. Die Temperatur wurde konstant bei 22 °C gehalten und die Lichter wurden um 6:00 bzw. 18:00 Uhr ein- und ausgeschaltet, um 12-stündige Hell-Dunkel-Zyklen aufrechtzuerhalten und Aktivitätsmuster mit zirkadianen Zyklen zu korrelieren. Pro jedem Experiment (n = 3 experimentelle Wiederholungen) wurden End.LepR-WT und End.LepR-KO (n = 4 Mäuse pro Experiment) untersucht. Das CalR-Webtool wurde zur Analyse der Rohdaten der indirekten Kalorimetrie zur Erstellung von Diagrammen und statistischen Analysen verwendet. Die Stoffwechselparameter wurden auf das jeweilige individuelle Körpergewicht der Mäuse normalisiert, das zu Beginn der Äquilibrierungsphase aufgezeichnet wurde63.

In Untergruppen von Wurfgeschwistermäusen wurden Glukosetoleranztests durchgeführt, nachdem sie 14 Wochen lang mit SD oder HFD gefüttert worden waren. Nach der Nahrungsentnahme für 6 Stunden (mit Trinkwasser ad libitum), wie für Stoffwechselstudien an Mäusen empfohlen64, wurde den Mäusen eine 20 %ige Glucoselösung in einer Dosis von 2 g/kg Körpergewicht (Volumen der ip-Glucose-Injektion) intraperitoneal injiziert (μL) = 10 × Körpergewicht (g)) und der Blutzuckerspiegel (Schwanzvene) wurden vor und 15, 30, 60 und 120 Minuten nach der Glukoseverabreichung mit dem Blutzuckermesssystem CONTOUR® NEXT (Ascensia Diabetes Care) bestimmt Bestände).

Nach 16 Wochen HFD wurden die Mäuse tief betäubt (mit einer Mischung aus Ketaminhydrochlorid [75 mg/kg Körpergewicht] und Xylazinhydrochlorid [15 mg/kg Körpergewicht)] in 0,9 %iger Natriumchloridlösung) und Vollblut entnommen durch Herzpunktion zur Messung des Nüchternglukosespiegels, wie oben. Der Rest wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerinnen gelassen, gefolgt von der Serumzubereitung. Mäuse wurden durch Zervixluxation unter tiefer Anästhesie getötet. Ihr Gehirn, ihr viszerales perigonadales Fettgewebe (VAT) und ihre Leber wurden entnommen, gewogen und für nachfolgende molekulare oder histologische Analysen oder die Isolierung von Endothelzellen vorbereitet. Bei einigen Mäusen wurde Rhodamin-markiertes Leptin (FR-003-13, Phoenix Pharmaceuticals; 5 mg/kg Körpergewicht) 45 Minuten vor der Gewebeentnahme durch intraperitoneale (ip) Injektion injiziert. Anschließend wurde 15 Minuten vor der Gewebeentnahme fluoresceinmarkiertes Lektin I aus Griffonia Simplicifolia (FL-1201, Vector Laboratories) intrakardial (ic) injiziert, um funktionelle Blutgefäße und Mikrogliazellen in vivo zu markieren. Die Gewebe wurden für die Kryokonservierung und die Fluoreszenzmikroskopieanalyse vorbereitet.

Das Serum wurde durch 10-minütige Zentrifugation bei 3000 U/min hergestellt und bis zur Analyse bei –80 ° C gelagert. Der Nüchtern-Serumglukosespiegel wurde mithilfe kolorimetrischer Tests (BioAssay Systems) gemessen. Kommerzielle enzymgebundene Immunoassays wurden eingesetzt, um die zirkulierenden Spiegel von murinem Leptin (R&D Systems Inc; Nachweisbereich: 1,58–5,56 pg/ml), löslichem Leptinrezeptor (sLepR; Antikörper online, ABIN773812) oder Insulin (Crystal Chem, #90060; Nachweisbereich: 0,1–12,8 ng/ml), gemäß Herstellerangaben.

Zur Vorbereitung von in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten und der Histologie wurde ein Teil der Mehrwertsteuer über Nacht in 4 % Zinkformalin (Sigma) fixiert, gefolgt von einer Inkubation in 70 % Ethanol (Carl Roth) und in Paraffin eingebettet (Surgipath® Paraplast; Leica Biosystems). . Fünf µm dicke serielle Querschnitte wurden entparaffiniert und mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt, um die einzelne Adipozytenfläche zu messen. Für die Immunhistochemie wurden entparaffinierte Schnitte in einer Reihe von abgestuftem Alkohol gewaschen, gefolgt von einer hitzeinduzierten Antigengewinnung (in 0,01 M Citratpuffer, pH 6,0 für 6 Minuten), bevor sie mit 10 % normalem Serum (abcam) blockiert wurden. Die Schnitte wurden über Nacht bei 4 °C mit primärem monoklonalem Rattenantikörper gegen Mac2 (CL8942AP; Cedarlane Laboratories; Verdünnung 1:400 in Antikörperverdünnungsmittel (Dako)) inkubiert. Zum Nachweis wurden die Schnitte mit sekundärem Antikörper (Verdünnung: 1:1000; Molecular Probes) inkubiert, gefolgt von Avidin-Biotin-Komplex (Vector Laboratories) und Aminoethylcarbazol-Substrat (abcam), bis sich die Farbe entwickelte. Die Schnitte wurden kurz mit Gill-Hämatoxylin (Sigma) gegengefärbt, in ImmuMount (ThermoScientific) montiert und mit 20-facher Vergrößerung (Olympus BX51-Mikroskop) fotografiert. Mac2-Immunsignale wurden mit der Software Image-Pro Plus (Version 7.0) (Media Cybernetics Inc.) als Prozentsatz der Gesamtfläche quantifiziert. Zur Kryokonservierung und zur Vorbereitung von Kryoschnitten wurden die Gewebe sofort in Tissue-Tek OCT-Compound (Sakura über Science Services GmbH) eingebettet. Um die Lipidansammlung in der Leber zu analysieren, wurden acht Mikrometer dicke Kryoschnitte 15 Minuten lang in 4 % Formaldehyd fixiert, dreimal in 1 × PBS gewaschen und anschließend 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit 0,5 % Oil Red O (Sigma) gefärbt. Die Gewebe wurden gewaschen, mit Hämatoxylin gegengefärbt und mit 20-facher Vergrößerung unter einem Umkehrlichtmikroskop (Motic AE31, Motic) fotografiert.

Die einzelne Adipozytenfläche wurde wie zuvor beschrieben65 bestimmt. Kurz gesagt, 5 µm dicke Querschnitte durch die Mehrwertsteuer wurden mit H&E gefärbt und mit 10-facher Vergrößerung unter Verwendung eines Olympus BX51-Mikroskops fotografiert. Von jedem Querschnitt wurden fünf repräsentative Bilder aufgenommen, und mindestens 10 Adipozyten pro Bild wurden zufällig ausgewählt und mithilfe einer Bildanalysesoftware (Image-Pro Plus, Version 7.0) gemessen. Die Ergebnisse wurden pro Maus gemittelt. Der Oil Red O-positive Bereich auf Leberschnitten wurde anhand von 5 Bildern pro Tier bestimmt und die Ergebnisse pro Maus gemittelt.

Für die Immunfluoreszenzanalyse wurden 8 µm dicke Kryoschnitte wie unten beschrieben verarbeitet. Die Schnitte wurden 5 Minuten lang bei Raumtemperatur aufgetaut und mit 1 × PBS (pH 7,5) gewaschen (2 × 5 Minuten), gefolgt von einer 10-minütigen Fixierung in eiskaltem Aceton (PanReac AppliChem) bei –20 °C. Die Schnitte wurden mit 1 × PBS (3 × 5 Min.) gewaschen und rehydratisiert und in 0,05 % Triton X-100 (in PBS; Roth) 10 Min. bei 37 °C permeabilisiert. Der Primärantikörper wurde in Antikörperverdünnungsmittel (Dako) verdünnt und die Schnitte über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die folgenden primären Antikörper wurden verwendet: Anti-Mac2 (CL8942AP; Cedarlane Laboratories), Anti-CD206 (ab64693; abcam), Anti-VEGF (ABS82, Millipore), Anti-LepR (AF498; R&D Systems) und Anti-CD31 ( sc18916; Santa Cruz Biotechnology). Die Schnitte wurden mit PBS gewaschen, gefolgt von einer 2-stündigen Inkubation mit dem Sekundärantikörper in 1 × PBS bei Raumtemperatur im Dunkeln. Die folgenden sekundären Antikörper waren: Alexa Fluor™ Plus 647 Esel-Anti-Ziege (A32849; Life Technologies), Alexa Fluor™ 488 Ziege-Anti-Ratte (ab150157; abcam), Alexa Fluor™ 555 Ziege-Anti-Ratte (ab150154; abcam) , Alexa Fluor™ Plus 488 Ziegen-Anti-Kaninchen (A32731, Life Technologies) und Alexa Fluor™ Plus 555 Ziegen-Anti-Kaninchen (A32732; Life Technologies). Zellkerne wurden unter Verwendung von 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI; Sigma) sichtbar gemacht. Um eine unspezifische Immunfärbung auszuschließen, wurden die Schnitte nur mit sekundären Antikörpern inkubiert. Die Bilder wurden mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop (Keyence; BZ-X810) aufgenommen, das mit einer 40-fachen Objektivlinse und der Bildsoftware BZ-X800 ausgestattet war. Immunsignale wurden mit der Image-Pro Plus-Software an mindestens 5 Bildern pro Tier quantifiziert und die Ergebnisse pro Maus gemittelt.

Primäre murine Endothelzellen (mPECs) wurden aus Gehirn, Lunge und Mehrwertsteuer isoliert. Primäre Endothelzellen aus dem Gehirn und der Mehrwertsteuer wurden mit dem Papain Dissociation System (Worthington) gemäß dem im Datenblatt bereitgestellten Protokoll isoliert. Primäre Maus-Endothelzellen aus der Lunge von End.LepR-WT- und End.LepR-KO-Mäusen wurden mithilfe magnetischer Zellsortierung mit Maus-CD31-Mikrokügelchen (Miltenyi Biotec) isoliert, wie zuvor beschrieben10. Die Zellen wurden auf mit 0,1 % Gelatine beschichteten Zellkulturplatten kultiviert und bis zur Konfluenz in Endothelzellwachstumsmedium MV2 (PromoCell) gehalten. Die Zellen wurden zwischen den Passagen 0 und 2 analysiert.

Um die gesamte ATP-Produktionsrate aus Glykolyse und Mitochondrienatmung in lebenden Endothelzellen zu untersuchen, wurde der Seahorse XFp Real-Time ATP Rate Assay mit dem Seahorse XF96e Extrazellulären Flussanalysator (Agilent Technologies) durchgeführt. Einen Tag vor der Durchführung des Tests wurden Endothelzellen in mit Gelatine beschichtete Polystyrol-Zellkulturplatten XF96 (V3) (Agilent Technologies) ausplattiert und in MV2-Medium (PromoCell) kultiviert. Nach 24 Stunden wurde das Medium gegen XF-Assaymedium (XF RPMI mit 1 mM HEPES; Agilent Technologies; Nr. 103576-100) ausgetauscht, ergänzt mit 1 mM Pyruvat, 2 mM L-Glutamin und 25 mM Glucose (alle Sigma-Aldrich). und Zellen, die bei 37 °C in einem SpectraMax i3 (VWR; INCU-Line) inkubiert wurden, der als Nicht-CO2-Inkubator für 45 Minuten verwendet wurde, während Hellfeld-Konduktionsbildgebung zur Dokumentation der homogenen Aussaat von Zellen durchgeführt wurde. Nach der Kalibrierung und Initialisierung der Sensorkartusche wurden drei Basislinienmessungen vor der Zugabe jeder Verbindung und drei Reaktionsmessungen nach aufeinanderfolgenden Injektionen des ATP-Synthase-Inhibitors Oligomycin (1,5 μM) aus Port A, des Komplex-1-Inhibitors Rotenon ( 0,5 µM) und der Komplex-3-Inhibitor Antimycin A (0,5 µM), beide aus Port B. Nach Abschluss des Assays wurden die Zellen mit BioTracker NIR694 Nuclear Dye (Sigma, #SCT118) gefärbt und zur Normalisierung mit dem SpectraMax MiniMax 300 Imaging gezählt Zytometer (Molekulare Geräte). Zellkerne wurden mithilfe der SoftMaxPro 6.5.1-Software automatisch identifiziert, indem Größe und Schwellenwert für die Objektidentifizierung im roten Kanal eingestellt wurden. Die Datenanalyse wurde mit der Wave 2.6.3.5-Software (Agilent Technologies) durchgeführt.

Die Gesamt-RNA wurde aus primären murinen Endothelzellen mit TRI Reagent® (Ambion)-Lösung isoliert, wie zuvor beschrieben10. Um Gesamt-RNA aus Fettgewebe zu isolieren, wurde frisch geerntete Maus-VAT in kleine Stücke geschnitten und in ein 2 ml RNase/DNase-freies Röhrchen mit 0,5 ml TRI-Reagenz überführt und mechanisch auf Eis homogenisiert (Miccra-Homogenisator). Das Homogenat wurde 15 Minuten lang bei 12.000 × g zentrifugiert, um die Lipidfraktion auf der Oberfläche der wässrigen Phase zu entfernen. Die wässrige Phase wurde dann in ein frisches 1,5-ml-Röhrchen überführt, gefolgt von anschließenden RNA-Isolierungsschritten der Phasentrennung unter Verwendung von 100 µl Chloroform, kräftig gemischt und 15 Minuten lang bei 12.000 × g und 4 °C zentrifugiert. Die wässrige Schicht wurde in ein frisches Röhrchen mit 500 µL Isopropylalkohol überführt und gemischt, um die RNA auszufällen. Nach 20-minütiger Inkubation auf Eis wurde die präzipitierte RNA 10 Minuten lang bei 12.000 × g und 4 °C zentrifugiert. Das RNA-Pellet wurde zweimal mit 75 % Ethanol gewaschen und an der Luft getrocknet, bevor es in RNAse-freiem Wasser gelöst wurde. Die Konzentration und Qualität der isolierten RNA wurde spektrometrisch überprüft (Nanodrop; Thermo Scientific). Ein μg Gesamt-RNA wurde unter Verwendung von M-MLV-Reverse-Transkriptase (Promega) nach DNase-Behandlung (Sigma) revers in cDNA transkribiert. Quantitative Echtzeit-RT-PCR (qRT-PCR) wurde mit SYBR® Green (BioRad) und dem CFXConnect Real-Time PCR Detection System (BioRad) durchgeführt. Die Ergebnisse wurden mit der ΔΔCt-Methode quantifiziert. Schwellenwerte (Ct) der Gene von Interesse wurden zunächst auf die Ct-Werte der Referenzgene normalisiert, um ΔCt-Werte (= Ct-Gen von Interesse – Ct des Referenzgens) unter Verwendung von Actin (ACTA; für Endothelzellen) oder der lateralen Stieluntereinheit P0 des ribosomalen Proteins zu erhalten (RPLP0; für Fettgewebe). Um das Expressionsmuster von Genen in End.LepR-KO-Mäusen mit WT-Mäusen zu vergleichen, wurden 2−ΔΔCt-Werte berechnet und als -fache Veränderung gegenüber Wildtyp-Mäusen ausgedrückt (= ΔCt von End.LepR-KO/ΔCt von End.LepR- WT). Die für die Echtzeit-PCR verwendeten Primersequenzen waren: LepR-Kurzisoform: for-GAA GTC TCT CAT GAC CAC TAC AGA TGA und rev-TTG TTT CCC TCC ATC AAA ATG TAA; Lange LepR-Isoform: für – GCA TGC AGA ATC AGT GAT ATT TGG und rev – CAA GCT GTA TCG ACA CTG ATT TCT TC; Fettsäurebindendes Protein-4 (Fabp4): für – GAT GCC TTT GTG GGA ACC TGG und rev – TTC ATC GAA TTC CAC GCC CAG; Catenin Beta-1 (Ctnnb1): für – TTA AAC TCC TGC ACC CAC CAT und rev – AGG GCA AGG TTT CGA ATC AA; Ccnd1; für – GTT CGT GGC CTC TAA GAT GAA GGA und rev – CAC TTG AGC TTG TTC ACC AGA AGC; Perilipin-1 (Plin1): für – CTT TCT CGA CAC ACC ATG CAA ACC und rev – CCA CGT TAT CCG TAA CAC CCT TCA; Leptin (Lep): für – GGA TCA GGT TTT GTG GTG CT und rev – TTG TGG CCC ATA AAG TCC TC; Pdgfra: für – TAT CCT CCC AAA CGA GAA TGA GA und rev – GTG GTT GTA GTA GCA AGT GTA CC; Pparg: für – CTCACAATGCCATCAGGTTT und rev – CTC TTG CAC GGC TTT CTA CGG; Pref1: für – CGT GAT CAA TGG TTC TCC CT und rev – AGG GGT ACA GCT GTT GGT TG; Glukosetransportermitglied 1 (Glut1): für – GCA GTT CGG CTA TAA CAC TGG und rev – GCG GTG GTT CCA TGT TTG ATT G; oder Isocitratdehydrogenase (Idh): für – GGA GAA GCC GGT AGT GGA GA und rev – GGT CTG GTC ACG GTT TGG A; oder Sirtuin-3 (Sirt3): für – ATC CCG GAC TTC AGA TCC CC und rev – CAA CAT GAA AAA GGG CTT GGG; Nr. 3: für – GAC CCT CAC CGC TAC AAC AT und rev – CTG GCC TTC TGC TCA TTT TC; Auswahl: für – ATG CCT CGC GCT TTC TCT C und rev – GTA GTC CCG CTG ACA GTA TGC; und Vcam1: für – CTT CAT CCC CAC CAT TGA AG und rev – TGA GCA GGT CAG GTT CAC AG.

Frisch geerntete Mehrwertsteuer wurde in eiskaltes PBS überführt, zerkleinert und in Kollagenaselösung (1 mg/ml Kollagenase II in RPMI-Medium) bei 37 °C für 1 Stunde unter ständigem Schütteln verdaut (ThermoMixer® C; Eppendorf). Nach 1 Stunde wurde das Gewebe durch ein 70-μm-Zellsieb (Greiner Bio-One) geleitet, um unverdaute Zelltrümmer zu entfernen, und mit FACS-Puffer (1 % FBS, 2 mM EDTA in PBS) gewaschen, um die Adipozyten zu sammeln. Eine gleiche Anzahl von Zellen wurde 10 Minuten lang mit unmarkiertem monoklonalem Antikörper (mAb) gegen CD16/CD32 (eBioscience) inkubiert, um die unspezifische Fc-Rezeptor-vermittelte Bindung zu blockieren. Monozyten und Makrophagen wurden 30 Minuten lang mit Allophycocyanin (APC)-eFluor-780 oder BV/11-markiertem Anti-Maus-CD45 und Fixable Viability Dye eFluor506, APC-markiertem Anti-Maus-CD11b, PE-markiertem Anti-Maus-CD115, PerCP gefärbt -Cy5.5-markiertes Anti-Maus-Ly6C, BV650-markiertes Anti-Maus-CD11c, Pacific Blue-markiertes Anti-Maus-F4/80, Fluoresceinisothiocyanat-markiertes Anti-Maus-CX3CR1 und APC-Cy7-markiertes Anti-Maus-Haupthistokompatibilität Komplex (MHC) Klasse II. T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen und polymorphkernige Leukozyten wurden durch Anfärben mit PE-Cy7-markierten Anti-B220-, Anti-CD3-, Anti-NK1.1- und Ly6G-Antikörpern (alle von BioLegend) ausgeschlossen. Alle Durchflusszytometriemessungen wurden auf einem BD LSR II (Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland) durchgeführt. Für die Datenanalyse wurde Flow Jo Version 10 verwendet.

Quantitative Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Die Normalverteilung wurde mit dem Shapiro-Wilk-Normalitätstest untersucht. Unterschiede zwischen zwei Gruppen wurden mit dem Student-t-Test für ungepaarte Mittelwerte oder dem Mann-Whitney-Test getestet, wenn die Normalverteilung nicht bestätigt wurde. Wenn mehr als zwei Gruppen verglichen wurden, wurde eine einfaktorielle oder zweifache Varianzanalyse (ANOVA) gefolgt von Sidaks Mehrfachvergleichstest durchgeführt, wenn die Werte normalverteilt waren, oder ein Kruskal-Wallis-Test gefolgt von Dunns Mehrfachvergleichstest, wenn dies nicht der Fall war. Für den Vergleich zweier Gruppen zu unterschiedlichen Zeitpunkten wurde die Zwei-Wege-ANOVA verwendet. Statistische Signifikanz wurde angenommen, wenn P einen Wert < 0,05 erreichte. Alle Analysen wurden mit der Datenanalysesoftware GraphPad PRISM (Version 9.0 für Windows; GraphPad Software Inc.) durchgeführt.

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Die Autoren danken Marina Thielen und Michaela Moisch (Abteilung für Kardiologie, Universitätsmedizin Mainz, Deutschland) für die hervorragende technische Unterstützung. Die Studie wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (SCHA 808/7-1 und SCHA808/15-1) und dem Deutschen Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung (DZHK Shared-Expertise [SE]-94) unterstützt. KS ist leitender Forscher des DZHK (Standort Rhein-Main, Mainz). KZ wird durch ein Doktorandenstipendium des Marie Skłodowska Curie Innovative Training Network „TICARDIO“ (Fördervereinbarung Nr. 813409) unterstützt.

Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL.

Klinik für Kardiologie, Kardiologie I, Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg-Universität Mainz, Mainz, Deutschland

Rajinikanth Gogiraju, Astrid Hubert, Luisa Renner, Magdalena L. Bochenek & Katrin Schäfer

Zentrum für Thrombose und Hämostase, Universitätsmedizin Mainz, Mainz, Deutschland

Claudius Witzler, Fatemeh Shahneh, Magdalena L. Bochenek, Konstantinos Zifkos, Christian Becker und Madhusudhan Thati

Klinik für Dermatologie, Universitätsklinikum Münster, Münster, Deutschland

Christian Becker

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Konzeption und Design der Studie: RG, TM und KS; Erfassung und Analyse der Daten: RG, CW, AH, MLB, KZ, FS und LR Verfassen und Bearbeiten des Originalmanuskriptentwurfs: RG, CB, TM und KS

Korrespondenz mit Katrin Schäfer.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Gogiraju, R., Witzler, C., Shahneh, F. et al. Die Deletion endothelialer Leptinrezeptoren bei Mäusen fördert ernährungsbedingte Fettleibigkeit. Sci Rep 13, 8276 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35281-7

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Eingegangen: 19. Januar 2023

Angenommen: 16. Mai 2023

Veröffentlicht: 22. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35281-7

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